Isabel Rosario Dawson è nata a New York il 9 maggio del 1979, da Greg Dawson, un costruttore edile e da Isabel Celeste una cantante statunitense di origini portoricane e afro-cubane. Rosario ha un fratello più giovane, Clay. Ha frequentato la scuola a Manhattan, con il sogno di diventrare una biologa marina. Tutto cambia all'età di 16 anni quando viene notata dal regista Larry Clark, che le offre una parte nel suo film debutto, Kids- Monelli. La Dowson decise quindi di continuare la sua carriera cinematografica e frequentò il Lee Strasberg Theatre and Film Institute. Nel 1998 entra nel super cast di He Got Game, scritto e diretto da Spike Lee. Nell'anno successivo, è una delle protagoniste del film drammatico Una voce per gridare di Craig Bolotin. Tra il 2000 e il 2002, Rosario è nel cast di quattro film commmedie: Pazzo di te di Kris Isacsson, Josie and the Pussycats di Harry Elfont, I marciapiedi di New York di Edward Burns e Pluto Nash con Eddie Murphy. Sempre nel 2002 è ingaggiata per due progetti che si rileveranno di grande successo: la
commedia fantascientifica di Barry Sonnenfeld, Men in Black II e l'intenso film di Spike Lee, La 25ª ora, in cui interpreta la compagna di un ex spacciatore condannato a sette anni di carcere. Nel 2004 intepreta Roxane, una giovane asiatica che sposa Alessandro Magno, nel colossal di Olver Stone, Alexander, successivamente è la prostituta Gail nella nella trasposizione cinematografica della graphic novel, Sin City di Frank Miller e Robert Rodriguez. L'anno successivo è protagonista di altre pellicole: Clerks II di Kevin Smith, Guida per riconoscere i tuoi santi dell'esordiente Dito Montiel e Extrema - Al limite della vendetta, del quale è anche produttrice. Nel 2007 ha lavorato con Quentin Tarantino nel film Grindhouse - A prova di morte e ha partecipato al film Killshot di John Madden. Nel 2008 ha recitato insieme a Will Smith nel film Sette anime di Gabriele Muccino, e nel film del 2010, Percy Jackson e gli dei dell'Olimpo - Il ladro di fulmini, nel ruolo di Persefone. Viene scelta da Danny Boyle per il film drammatico In Trance, e torna nelle vesti di Gail nel fortunato sequel Sin City - Una donna per cui uccidere. Nel 2014 viene presentato a Cannes il thriller di Atom Egoyan, Captives, dove recita come protagonista insieme a Ryan Reynolds.