Pierfrancesco Favino nasce a Roma, da genitori pugliesi, il 24 agosto 1969. Frequenta l'Accademia Nazionale d'Arte Drammatica Silvio D'Amico della Capitale, e comincia la gavetta in teatro e in Tv, dove si accontenta di ruoli secondari in fiction di successo come Amico mio, Padre Pio e Ferrari.
La parte di Gino Bartali lo consacra come protagonista sul piccolo schermo dell'omonima miniseriededicata alla figura del grande ciclista, per la quale l'attore si allena duramente macinando chilometri di pedalate al giorno.
Nel 2001 appare in L'ultimo bacio di Gabriele Muccino, al fianco di Stefano Accorsi, ed è il solo nella compagnia di amici a vantare un matrimonio stabile nel gruppo di trentenni immaturi e scapestrati.
In seguito interpreta il sergente Rizzo nel film di guerra diretto da Enzo Monteleone, El Alamein - La linea del fuoco, ruolo drammatico che gli vale la candidatura al David di Donatello.
Riesce nei toni leggeri della commedia a dar vita a personaggi outsider, inetti e impacciati: è lo sconclusionato Riccardo in Al cuore si comanda con Claudia Gerini, l'artista squattrinato Vincenzo in Mariti in affitto con Mariagrazia Cucinotta, il timido e anonimo Piero in Nessun messaggio in segreteria al fianco di Carlo Delle Piane.
Nel 2005 cambia registro, ottenendo il ruolo del Libanese in Romanzo criminale, il film ispirato alle vicende della feroce Banda della Magliana diretto da Michele Placido e tratto dall'omonimo romanzo di Giancarlo De Cataldo.
L'interpretazione gli frutta un David di Donatello come Miglior attore non protagonista, e un Nastro d'argento ex aequo con Claudio Santamaria e Kim Rossi Stuart per il Miglior attore protagonista.
L'anno successivo recita in La sconosciuta di Giuseppe Tornatore e più tardi nel film Saturno contro di Ferzan Özpetek accanto a Luca Argentero.
Dopo il debutto nel cinema americano, nei panni della statua di bronzo di Cristoforo Colombo nel film di Shawn Levy Una notte al museo con Ben Stiller, recita in numerose produzioni hollywooddiane: lo vediamo in Le cronache di Narnia - Il principe Caspian di Andrew Adamson, prodotto dalla Walt Disney e tratto dai romanzi per ragazzi scritti da C. S. Lewis; nel film di Spike Lee, ambientato durante la seconda guerra mondiale, Miracolo a Sant'Anna; nel thriller diretto da Ron Howard sull'omonimo romanzo di Dan Brown, Angeli e Demoni, al fianco di Tom Hanks e Ewan McGregor.
Intanto torna a recitare per il piccolo schermo nella miniserie andata in onda su Rai1 Pane e libertà, incentrata sulla vita del sindacalista Giuseppe di Vittorio. è la volta di due sequel, prima riprende la piccola parte dell'eploratore Colombo in Una notte al museo 2- La fuga, poi il ruolo di Marco nel film che ha lanciato la sua carriera al cinema, Baciami ancora di Muccino, e puntuale arriva un'altra nomination ai David come miglior attore non protagonista.
Nel 2012 alterna diversi generi, dramamatico, con ACAB - All Cops Are Bastards primo film di Stefano Sollima per il grande schermo, storico, con Romanzo di una strage di Marco Tullio Giordana, film che racconta i fatti della strage di piazza Fontana, commedia, in Posti in piedi in paradiso di Carlo Verdone con Marco Giallini.
Oltreoceano appare nell'horror apocalittico World War Z di Marc Forster con Brad Pitt e nel film di Ron Howard sulla Formula 1, Rush. Torna a lavorare con Sollima nel suo secondo film per il cinema, Suburra con Claudio Amendola ed Elio Germano. Per Le confessioni di Roberto Andò riceve la sua quinta nomination ai David come Miglior attore non protagonista. Nel 2017 è accanto a Kasia Smutniak nella commedia di Simone Godano Moglie e marito.
Ha doppiato Daniel Day Lewis in Nine e Lincoln e Vincent Cassel in Il racconto dei racconti. Dal 2003 è legato sentimentalmente all'attrice Anna Ferzetti, con la quale ha due figlie.