Diego Abatantuono nasce nel maggio del 1955 a Milano, ma cresce alle Case Minime, col padre calzolaio di Vieste e la mamma Rosa di Como, costumista del Derby, teatro di cabaret gestito dai suoi zii. Questo basta a far respirare al buon Diego l'aria dello spettacolo sin da piccolo, portandolo presto sulle scene, da ragazzo, insieme ai Gatti di Vicolo Miracoli. Più avanti, negli anni Settanta, si esibirà con gli amici di una vita: Giorgio Faletti, Massimo Boldi, Enzo Jannacci. Al cinema approda nel 1976, con un ruolo nel similpolizziottesco Liberi armati pericolosi di Romolo Guerrieri, dov'è quasi irriconoscibile senza i suoi tipici baffoni. Negli ultimi anni Settanta partecipa però a diversi film comici, colpendo l'immaginario collettivo italiano come leggendario panettiere Cecco di Fantozzi contro tutti (1980). Il primo ruolo da protagonista arriva tuttavia nel 1981, quando è Monica Vitti a volerlo al suo fianco per Tango della gelosia, con la regia di Steno.
E' il preludio a tre-quattro anni di fuoco che lo trasformano in uno dei re del botteghino italiano: interpreta per la regia di Carlo Vanzina suoi cavalli di battaglia in Eccezziunale... veramente (per il quale scrive anche la canzone dei titoli e veste i panni di tre personaggi), Viuuulentemente mia (1982) e Il ras del quartiere (1983). Tra questi c'è da segnalare pure il proverbiale Attila flagello di Dio (1982) di Castellano & Pipolo, dove entra nel mito lo spelling del nome del temibile condottiero "unno".
Dopo tre anni di pausa, durante i quali si sposa nel 1984 (il matrimonio durerà tre anni), nel 1986 spiazza il pubblico presentandosi come attore decisamente serio in Regalo di Natale di Pupi Avati, ottenendo un Nastro d'Argento come migliore non protagonista e una nomination ai David di Donatello. Nel 1987 bissa l'impegno con il bel ruolo del padre del protagonista in Un ragazzo di calabria di Luigi Comencini, facendo pure un cameo nel primo film di Gabriele Salvatores, Kamikazen. Proprio Salvatores, dopo Avati, è il regista che gli garantisce un percorso attoriale più sperimentale: è nei cast dei generazionali Marrakech Express (1989), Turnè (1990), il plurimpremiato Mediterraneo (1991) e Puerto Escondido (1992, Nastro d'Argento come migliore protagonista).
Dal 1990 comunque cerca di mantenere parallele la sua vena cabarettistica mai sopita con le interpretazioni più complesse: riprende infatti gag tipiche in lavori come Vacanze di Natale '90, Paparazzi (1998) e Tifosi (1999), ma allo stesso tempo prosegue il rapporto con Salvatores, con Nirvana (1997), nel quale è addirittura il personaggio di un videogioco, Amnèsia (2002), Io non ho paura (2003, Nastro d'Argento migliore non protagonista) e Happy Family (2010). Nel frattempo ha anche ripreso il rapporto con Avati, per Il testimone dello sposo (1997), La rivicita di Natale (2004), La cena per farli conoscere (2006), Gli amici del Bar Margherita (2009). In mezzo c'è una prestigiosa cointerpretazione con Sergio Castellitto del Concorrenza sleale (2000) di Ettore Scola.
Al di là dei sodalizi storici con Salvatores e Avati, è sempre attivo come caratterista anche in piccole parti in commedie italiane, come il recente I Babysitter. Affezionato al mondo del cabaret, ha cofondato, e nei primi anni Duemila condotto, la trasmissione Colorado Cafè.