Claudio Santamaria debutta appena sedicenne nel doppiaggio, prima di frequentare il corso triennale di Acting Training curato da Beatrice Bracco e iniziare a recitare sui palcoscenici della capitale. Il suo debutto al cinema avviene con L'ultimo capodanno di Marco Risi, dal libro di Niccolò Ammaniti, dove ha il ruolo di Cristiano. Il film, però, esce nelle sale l'anno successivo a Fuochi d'artificio di Leonardo Pieraccioni (1997), dove è Er Banana e che perciò lo precede nella sua filmografia.
Nel 1998 appare in due film molto importanti: L'assedio di Bernardo Bertolucci e Ecco fatto, opera prima di Gabriele Muccino. Oltre che al cinema e in teatro è attivo anche in televisione, con titoli come La vita che verrà e Ama il tuo nemico. Inizia poi il nuovo millennio con un film non italiano, Terra del Fuoco, del celebre regista cileno Miguel Littìn. A questo fa seguire il giallo di Alex Infascelli Almost Blue, per tornare poi a lavorare con Gabriele Muccino nel film di grande successo L'ultimo bacio, per cui viene candidato al David di Donatello. Nel 2001 ricopre l'iconico ruolo di Penthotal, in Paz! di Renato De Maria, omaggio al grande fumettista Andrea Pazienza, e ottiene una nomination al Nastro d'Argento.
Tra i molti film del periodo lo troviamo protagonista del debutto registico di Maria Sole Tognazzi, Passato prossimo (sua seconda candidatura al Nastro d'argento), de Il cartaio di Dario Argento e Ma quando arrivano le ragazze? di Pupi Avati. Nel 2005 ottiene un grande successo popolare col ruolo del Dandi, uno dei boss della Banda della Magliana, in Romanzo Criminale di Michele Placido e si porta a casa il Nastro d'Argento. Nel 2006 arricchisce il suo curriculum internazionale interpretando Carlos nel film di 007 Casino Royale. Due anni dopo offre un'acclamata interpretazione del cantautore Rino Gaetano nel biopic televisivo Ma il cielo è sempre più blu, in cui si esibisce anche come cantante. Nello stesso anno (2008), presenta il Concertone del primo maggio a San Giovanni.
Al cinema compare in La terra degli uomini rossi di Marco Bechis, Il caso dell'infedele Klara di Roberto Faenza e nel sequel dell'Ultimo bacio, Baciami ancora, dove riprende il personaggio di Paolo. Nel 2010 è protagonista della miniserie tv Le cose che restano, prima di tornare al cinema con una serie di film il più importante dei quali è Diaz, che racconta le violenze della polizia a danni di manifestanti inermi durante il G8 del 2001. Nel 2014 interpreta un altro biopic televisivo, Non è mai troppo tardi, dedicato al maestro elementare e scrittore Alberto Mansi che nella tv degli anni Sessanta conduceva il programma omonimo in cui insegnava l'italiano a un popolo ancora in gran parte analfabeta. Al cinema interpreta l'opera prima Il venditore di medicine, Tre tocchi di Marco Risi e Torneranno i prati di Ermanno Olmi, prima del grande successo di critica Lo chiamavano Jeeg Robot. Nel 2015 torna in tv con E' arrivata la felicità. E' la voce italiana di Christian Bale nella trilogia di Batman di Christopher Nolan e ha doppiato anche Eric Bana in Munich.