Figlia degli attori Vittorio Mezzogiorno e Cecilia Sacchi, lavora per due anni a Parigi nel workshop teatrale del regista britannico Peter Brook. Nel 1995 debutta sul palcoscenico parigino dello storico Théâtre des Bouffes du Nord con lo spettacolo Qui est là, una ricerca teatrale creata e diretta da Peter Brook tratta dall'Amleto di Shakespeare e testi di Artaud, Brecht, Craig, Mayerhold, Stanislavski e Zeami. Per questa interpretazione riceve il Premio Coppola-Prati 1996. Il debutto cinematografico arriva con il film Il viaggio della sposa di Sergio Rubini. Da quel momento il cinema la cerca con costanza e la trova in film quali Del perduto amore di Michele Placido, che le vale un Nastro d’Argento, un Ciak d’Oro e un Premio Pasinetti come migliore attrice protagonista, Asini di Antonello Grimaldi, Un uomo perbene di Maurizio Zaccaro e Tutta la conoscenza del mondo di Eros Puglielli.
Il grande successo arriva con L’ultimo bacio di Gabriele Muccino nel quale interpreta con grande intensità la partner tradita di Stefano Accorsi. Nel 2002 accetta un ruolo difficile interpretando Ilaria Alpi per la regia di Ferdinando Vicentini Orgnani, vincendo un Nastro d’Argento come miglior attrice protagonista. Con il successivo La finestra di fronte di Ferzan Ozpetek raccoglie consensi da critica, pubblico e dai votanti dei maggiori premi artistici che le permettono di ricevere un David di Donatello, un Nastro d’Argento,un Globo d’Oro e il Best Actress Award al Karlovy Vary International Film Festival. Nel 2003 vince un altro Nastro D'Argento grazie al film L’amore ritorna di Sergio Rubini. Il 2004 segna un ritorno al teatro con lo spettacolo 4.48 Psychosis di Sarah Kane per la regia di Piero Maccarinelli.
Dopo la commedia francese Il club delle promesse, Giovanna Mezzogiorno recita nel dramma di Cristina Comencini che finisce nella cinquina dei candidati all'Oscar come miglior film straniero. Oltre al successo internazionale del film, l'interpretazione per La bestia nel cuore vale all'attrice la Coppa Volpi per la miglior interpretazione femminile al 62° Festival di Venezia. È protagonista di Lezioni di volo di Francesca Archibugi e di Notturno Bus di Davide Marengo, mentre nel 2007 recita in inglese accanto a Javier Bardem L’amore ai tempi del colera di Mike Newell, tratto dall'omonimo e celebre romanzo di Gabriel garcia Marquez. Seguono L’Amore non basta di Stefano Chiantini, Palermo Shooting di Wim Wenders e Vincere di Marco Bellocchio. Quest'ultimo consegna all'attrice un nuovo Nastro d’Argento e un nuovo Globo d’Oro come migliore attrice protagonista, oltre che un Silver Hugo for Best Actress al 45° Chicago International Film Festival.
È produttrice e voce narrante di Negli occhi, documentario sul padre Vittorio diretto da Daniele Anzellotti e Francesco Del Grosso. Sucecssivamente partecipa ai film La prima linea di Renato De Maria (2009), Basilicata coast to coast di Rocco Papaleo (2010), Vinodentro di Ferdinando Vicentini Orgnani (2012), I nostri ragazzi di Ivano De Matteo. Nel 2016 è la voce Kaa il serpente de Il libro della giungla, la versione live action firmata Disney, ed è nel cast di Come diventare grandi nonostante i genitori di Luca Lucini.
Recentemente è stata insignita, dal Ministero della Cultura francese, Chevalier de l'Ordre des Arts et des Lettres. Nel 2017 la vediamo diretta da Gianni Amelio in La tenerezza e sul palcoscenico per la tournée teatrale con lo spettacolo Sogno d’autunno di Jon Fosse per la regia di Valerio Binasco.