Umbra di nascita ma cresciuta a Sansepolcro in provincia di Arezzo, Valentina Lodovini si diploma nel 2004 al Centro Sperimentale di Cinematografia di Roma. Il debutto sul grande schermo arriva con Ovunque sei di Michele Placido. Nel 2006 è nel cast di Paolo Sorrentino per il film L'amico di famiglia, in concorso al Festival di Cannes, e sempre nello stesso anno partecipa al film di Francesca Comenicini A casa nostra. Il primo ruolo da protagonista arriva l'anno dopo grazie a Carlo Mazzacurati che la sceglie per La giusta distanza e le consente di ottenere il Premio Biraghi e una candidatura ai David di Donatello. Nel 2008 è protagonista in Germania del film Pornorama di Marc Routhemund e partecipa al film di Daniele Vicari Il passato è una terra straniera. Anna Negri le affida una parte nell'originale Riprendimi (selezionato al Sundance Film Festival), mentre nel 2009 interpreta il personaggio di Daniela in Fortapàsc di Marco Risi, film sul giornalista Giancarlo Siani ucciso nel 1985 dalla camorra. Anche grazie a Generazione 1000 euro di Massimo Venier, vince il Ciak d'Oro come "rivelazione dell'anno".
Il 2010 è l’anno che la consacra al box office. Valentina è protagonista de La donna della mia vita di Luca Lucini e della commedia campione d’incassi Benvenuti al Sud di Luca Miniero, film per il quale vince il David di Donatello come migliore attrice non protagonista. Nel 2011 accompagna al Festival di Venezia il film Cose dell'altro mondo di Francesco Patierno. L'anno successivo partecipa al sequel Benvenuti al Nord, sempre per la regia di Luca Miniero, e all’opera prima di Fabio Mollo Il sud è niente. Lavora con Marco Ponti in Passione sinistra prima di girare in Argentina il film L’inventore dei giochi di J.P. Buscardini. Nel 2014 Giovanni Veronesi le affida un ruolo in Una donna per amica, Marco Risi la richiama per Tre tocchi e entra nel cast de Milionari di Alessandro Piva. Dà vita a una vivace impiegata in Buoni a nulla di Gianni Di Gregorio prima di recitare nuovamente accanto a Claudio Bisio in Ma che bella sorpresa di Alessandro Genovesi. Nel 2016 Valentina è diretta da Roberto Faenza in La verità sta in cielo, film sulla vera e complicata storia che ha coinvolto Emanuela Orlandi, la ragazza quindicenne scomparsa a Roma nel 1983.